Cdk2ap1和Smarce1基因在鸡胚性腺发育中的功能研究

鸡胚性腺是重要的动物器官发生研究模型，性反转技术在养鸡生产中应用前景广阔，要高效利用鸡胚性腺模型及建立实用的性反转技术均需加强对性腺发育中调控基因的研究。在前一个基金项目（30671494）资助下，我们分离鉴定了部分在鸡胚性分化期呈性别差异表达的基因，本研究将利用逆转录病毒介导的超表达和RNAi技术验证分离到的Cdk2ap1和Smarcel两个基因在鸡胚性腺发育中的作用。研究将在鸡胚成纤维细胞和鸡胚两个层面进行，对靶基因分别从提高（增加）和降低其在细胞及胚胎中的表达水平两个方向上展开，通过分析靶基因表达水平改变后对细胞及鸡胚性腺形态、大小、组织结构、性腺特定细胞系的增殖分化以及相关基因表达水平的影响，综合判断靶基因在鸡胚性腺发育中的作用。本研究将能弄清Cdk2ap1和Smarcel基因在鸡胚性腺发育中的作用，为研究鸡胚性腺发育的基因调控网络和将来设计使用的性反转技术奠定基础

为推动鸡性腺发育相关基因功能研究的深入，本研究选择SMARCE1和 CDK2AP1两个基因，以及根据最新研究进展增加的FOXL2基因，利用逆转录病毒介导的RNAi和超表达技术研究这三个基因在鸡胚性腺发育中的作用。研究结果：1.成功构建了SMARCE1基因的重组逆转录病毒超表达载体和逆转录病毒RNAi表达载体，并获得高滴度的病毒颗粒，筛选出干涉效果最好的RNAi载体；Q-PCR及免疫荧光结果显示，在细胞中SMARCE1的超表达引起了SOX9、CYP19A1的表达及AR和ERα的上调表达；Q-PCR、WISH及免疫组化结果显示，在鸡胚中SMARCE1的超表达引起了CYP19A1在雄性中、SOX9在雌性中的表达，使AR的表达下调，ERα的表达上调；HE 染色结果显示，SMARCE1 超表达后鸡胚性腺在E12.5时卵巢皮质明显增厚，睾丸曲细精管增多，间质细胞增加；在细胞中干涉SMARCE1后SOX9、AR 及 ERα的表达均下调，但在鸡胚中干涉SMARCE1后引起鸡胚的大量死亡。2.成功构建CDK2AP1基因的重组逆转录病毒超表达载体和逆转录病毒RNAi表达载体，获得高滴度的病毒颗粒，并筛选出干涉效果最好的RNAi载体；Q-PCR及WB结果显示，在细胞中CDK2AP1 能显著上调 AR和 FOXO3a的表达，下调ERα及CDK2的表达；流式细胞仪检测结果显示，CDK2AP1超表达后，G1期细胞比例显著上升，S 期和 G2/M 期细胞比例显著下调；而在干涉CDK2AP1后，G1 期细胞比例显著下降，S 期细胞比例无变化，G2/M 期细胞比例显著上升。3.成功构建FOXL2基因的重组逆转录病毒超表达载体和逆转录病毒RNAi表达载体，获得高滴度的病毒颗粒，并筛选出干涉效果最好的RNAi载体；在细胞中超表达FOXL2后，WNT4、CYP19A1、ER的表达下调，AR的表达上调；干涉FOXL2后，AR表达无显著变化，WNT4、CYP19A1呈上调表达，ER呈下调表达。以上结果表明，SMARCE1通过调控ERα和AR的表达促进鸡胚性腺的发育；CDK2AP1通过调控 FOXO3a 和 CDK2 参与机体细胞增殖、细胞凋亡等途径而对胚胎和性腺发育起作用；FOXL2对于卵巢发育相关基因均有一定的调控作用。这些鸡胚性腺发育候选基因的功能验证，为进一步完善鸡胚性腺发育基因调控网络提供了重要线索。