Annexin 1核转位启动fas基因转录在脑缺血神经元凋亡中的机制研究

Annexin 1 (ANXA1) participate apoptosis process of Fas/ TRAIL death receptor pathway in tumor cells. However, ANXA1 relevance with Fas in the nervous system has not been reported. Preliminary studies in our group found that the ischemia-induced ANXA1 nuclear translocation and enriched in the fas gene transcription initiation region in neuron. The Phenomenon of ANXA1 nuclear translocation is arousing our interest. We speculated That ANXA1 nuclear translocation participate in the fas gene transcription and have to star the Fas/TRAIL death receptor pathway causing ischemic neuronal apoptosis. In clues of the ANXA1 into the nucleus on hypoxia-inducible in vivo- Organization-cells - molecular level, this study intends to confirm ANXA1 into the nuclear way and mediate its key molecules in first. Then explore how ANXA1 regulate the fas gene transcriptional after ANXA1 into the nucleus. Final proved ANXA1 promote fas expression and participate in cerebral ischemic neuronal apoptosis process. The study will be an accurate understanding of the molecular characteristics of ANXA1 and to provide an effective molecular targets to block neuronal damage.

Annexin 1(ANXA1)在肿瘤细胞中参加Fas/TRAIL死亡受体通路诱导的细胞凋亡过程，但在神经系统中ANXA1与Fas通路的相关研究未见报道。本课题组前期研究发现缺血诱导神经元ANXA1核转位并富集在fas基因转录起始区，ANXA1核转位的机制和意义引起我们的兴趣，我们推测ANXA1核转位参加了fas基因转录，并相继启动Fas/TRAIL死亡受体通路，引起缺血神经元凋亡。本研究拟在整体-组织-细胞-分子水平，以缺氧诱导神经元ANXA1入核为切入点，首先确认ANXA1的入核方式以及介导其入核的关键分子；探讨ANXA1入核后对fas基因的转录调控模式，鉴定ANXA1与fas基因相关转录因子及调控蛋白的关系；最后证明ANXA1促进Fas蛋白表达，进而通过死亡受体通路参加脑缺血神经元凋亡过程。本研究将明确ANXA1核转位引发神经元凋亡的机制，为拮抗缺血神经元损伤提供新的分子靶点。

脑缺血再灌注损伤后，膜联蛋白1（Annexin A1，ANXA1）核转位与神经元的凋亡密切相关，但ANXA1核转位及其诱导神经元凋亡的分子机制仍不清楚。在本项研究中，我们重点研究介导ANXA1核转位的关键分子及其是如何在细胞核中发挥凋亡调节的作用。我们发现FPR，myosin IIA及核转运受体importin β参与ANXA1的核转位过程，BOC1，Blebbistatin，Importazole均能抑制OGD/R损伤后神经元ANXA1入核。与此同时，我们发现ANXA1入核后直接富集于BID基因的启动子区域，并且这种富集作用能被p53抑制剂pifithrin-α阻断。进一步的实验结果证实ANXA1在细胞核中与转录因子p53存在相互作用，并且OGD/R损伤后，二者结合显著增强。荧光素酶报告基因检测实验结果显示ANXA1能上调p53的转录活性。同时，我们也观察到ANXA1的核转位能上调促凋亡分子Bid的表达。细胞凋亡检测实验结果显示沉默ANXA1可以抑制凋亡通路的活化进而减少OGD/R损伤后神经元凋亡。通过结构筛选及氨基酸序列分析，我们发现ANXA1中心结构域第三段重复序列Arg228-Phe237（RSFPHLRRVF）氨基酸残基为其核转位信号（NTS），该NTS序列介导ANXA1对p53的转录激活、Bid的调控以及参与细胞凋亡过程。针对ANXA1核转位信号，我们在其N-端融合一段细胞穿膜引导肽Tat，合成小分子肽Tat-NTS，发现该肽段能特异性阻断ANXA1核转位，降低p53转录活性，抑制Bid的表达，进而减弱细胞凋亡通路的活化，减轻OGD/R损伤后神经元凋亡。进一步的体内实验结果也显示，Tat-NTS肽能阻断脑缺血再灌注损伤诱导的ANXA1核转位，抑制神经元凋亡，减弱脑缺血梗死灶大小，改善脑缺血再灌注损伤后小鼠的神经功能及空间学习记忆能力。该研究为阐明ANXA1核转位在脑缺血再灌注损伤中的作用提供了新的理论基础和分子机制，进一步的研究可以为缺血性脑卒中的临床治疗提供新的研究策略和分子靶点。