脑脊液-视神经屏障中脑膜上皮细胞应激反应分子机制的研究

目前视神经疾病基础研究的热点大多侧重于神经胶质细胞、视网膜神经节细胞上，而对于包绕视神经的脑膜以及覆盖视神经脑膜的主要细胞成份－脑膜上皮细胞在视神经疾病中的作用的研究甚少。脑膜上皮细胞直接与脑脊液相接触，参与脑脊液-视神经屏障的构成，在保持屏障完整性上发挥重要作用，因此我们提出视神经脑膜上皮细胞在各种应激下发生结构和功能的变化，从而影响脑脊液-视神经屏障的正常生理作用，是导致视神经疾病的机制之一的假说。本课题以前期研究中成功建立的视神经脑膜上皮细胞原代细胞培养模型为研究基础，利用2DE-MS蛋白质组技术、逆转录-聚合酶链反应、Western-blot、流式细胞仪等研究方法，从分子基因水平探讨脑膜上皮细胞对各种应激的反应，评价脑膜上皮细胞参与脑脊液-视神经屏障的作用，为进一步研究视神经疾病奠定实验基础。

本项目提出作为被覆脑脊液-视神经屏障的主要细胞，视神经脑膜上皮细胞(meningothelia cells,MECs)在保证屏障完整性中起着重要的作用，在氧化应激反应出现结构和功能的变化，从而影响脑脊液-视神经屏障的功能。本研究利用2DE-MS蛋白质组学技术、逆转录-聚合酶链反应、Western-blot等研究方法，从分子基因水平探讨脑膜上皮细胞对各种应激的反应。通过本项目建立视神经脑膜上皮细胞原代细胞培养模型，探讨视神经脑膜上皮细胞参与脑脊液-视神经屏障的功能。利用包绕视神经的鞘膜－蛛网膜，分离出视神经脑膜上皮细胞；运用抗成纤维细胞磁珠，消除原代细胞中成纤维细胞的污染，纯化视神经脑膜上皮细胞；通过标记抗体鉴定脑膜上皮细胞，从而为视神经疾病的研究提供新的科学研究手段。本研究表明，缺氧可抑制体外培养的MECs增生，细胞直径增大，体积增加。此外，缺氧抑制细胞中ATP的产量和T-AOC水平，其机制可能与缺氧使细胞线粒体功能发生障碍，进一步影响线粒体呼吸链的功能，使活性氧的产生量增加，对细胞产生毒性作用，使T-AOC水平下降，抗氧化能力降低。同时，缺氧使钙联蛋白表达上调可能与激发内质网应激反应有关。MECs通过脑脊液中重要的蛋白-谷氨酸处理，T-AOC水平下降，SODmRNA表达减少，ROS产生增多；在氧化应激作用下，短时间内HSP90mRNA表达下调，随着作用时间延长，HSP90mRNA表达增多，表明谷氨酸的积累通过兴奋性毒性影响MECs功能。通过建立高眼压动物模型，检测高眼压对视神经脑膜上皮细胞内紧密连接蛋白的影响以及电镜观察高眼压下脑膜上皮细胞的超微结构，结果表明短期高眼压使Zo-1mRNA、Claudin1 mRNA 、以及MMP2 mRNA的基因表达量减少，HIF-1 mRNA表达增加，随着时间延长Occludin mRNA表达下调。超微结构提示高眼压使脑膜上皮细胞增殖明显, 蛛网膜组织增厚。本课题从分子基因水平探讨脑膜上皮细胞对各种应激的反应，评价脑膜上皮细胞参与脑脊液-视神经屏障的作用，为进一步研究视神经疾病奠定实验基础。