卵泡闭锁过程中miRNAs的分离、鉴定及其介导的表达调控研究

本项目拟解决的关键问题是：研究、揭示猪卵泡闭锁过程中miRNAs的参入及其调控作用。总体思路是：以卵泡闭锁的三个阶段（健康、轻度闭锁、闭锁）为突破口，依托本课题组表观遗传学及转基因动物研究平台，深入探讨卵泡闭锁过程中miRNAs介导的调控作用及机制。主要研究内容是：1）采用miRNAs表达谱芯片技术结合生物信息学方法筛选、鉴定不同闭锁程度卵泡中差异表达miRNAs，并利用stem-loop qRT-PCR技术进行表达验证分析；2）利用生物信息学工具进行差异表达miRNAs靶基因预测及功能分析；3）利用脂质体和慢病毒介导的小RNA干涉途径对miRNAs及其靶基因的功能验证分析；4）整合分析miRNAs及其对相关靶基因表达调控与卵泡闭锁的关系。本研究在动物卵泡闭锁调控领域尚属空白，本项目既是对卵泡闭锁调控机理的有益补充，也能为进一步人工干预卵泡闭锁进程、充分开发卵泡储备提供必要的理论基础。

本项目首先分析了几种可持续跟踪研究的卵泡闭锁分类方法（外观形态，颗粒细胞密度，P4和E2的比值）间的关系。结合表观形态，形成了合理的卵泡闭锁程度判定标准：颗粒细胞密度<2500个•μL-1、2500-10000个•μL-1及>10000个•μL-1分为健康、早期闭锁及晚期闭锁卵泡，而相应的P4和E2比值分别为P4/E2<5、5<P4/E2<20及P4/E2>20。随后，我们通过高通量miRNAs表达谱芯片技术构建了不同闭锁程度卵泡的miRNAs表达模式，结合生物信息学方法筛选、鉴定不同闭锁程度卵泡中差异表达的miRNAs。筛选得到23种表达活性显著变化的miRNAs，进而预测其靶基因，并对miRNAs及其靶基因进行生物学功能及调控网络等生物信息学分析。然后选择在卵泡闭锁过程中与细胞增殖、细胞分裂、细胞凋亡、DNA复制、细胞粘附、蛋白质向核内的运输等方面发挥重要作用的miRNAs进行进一步实验验证研究。转染小RNA，检测颗粒细胞凋亡和关键调控基因的表达活性，通过荧光素酶活性检测证实了ATM是miR-26b直接靶基因，miR-26b上调抑制DNA损伤修复，导致颗粒细胞凋亡，从而影响卵泡闭锁过程。同时，我们对特异性miRNAs(let-7a、miR-26b、miR-10b and miR-21)靶向类固醇激素合成酶信号通路以及TGF-beta/Smad信号通路调控猪卵泡闭锁进行探测。选择STAR、三个芳香化酶（CYP11、CYP17和CYP19）、HSD3β、PGR、FSHR、LHCGR，AR以及TGFBR1，Smad4，NR5A2等关键miRNAs靶基因在不同闭锁程度的猪卵泡中进行表达及调控分析。结果表明，由促卵泡素调控的芳香化酶活性能诱导卵泡闭锁，而孕激素和雄激素的产生进一步促进了卵泡闭锁过程。CYP19在早期闭锁阶段通过调节E2水平发挥作用，而CYP11和3b-HSD通过增加孕激素水平调节卵泡的闭锁进程，这些关键基因和卵泡内分泌微环境之间形成一个复杂的调控网络。