肺移植术后免疫活性细胞动态解析及其实时监测新方法

肺移植术后急性排斥反应诊断和治疗都是以T淋巴细胞介导组织学改变为基础，因此如何特异性、实时、动态监测移植肺组织中 T淋巴细胞等免疫活性细胞变化规律是急性排斥反应准确预测与早期诊断关键。本课题结合项目组前期工作拟通过微电极表面修饰和表面键合固定抗体技术，制备出对活体肺组织中免疫活性细胞有特异、灵敏、快速响应新型电化学探针，选用大鼠肺移植模型，采集不同时间支气管肺泡灌洗液和血清样本，以新型电化学探针检测其T淋巴细胞，并与流式检测结果对比，评价该探针检测准确性, 同时与病理和免疫组化数据对比, 评价其敏感性和特异性；进一步利用新型电化学探针，采取B超定位经皮穿刺方法实时监测活体移植肺组织中免疫活性细胞动态变化规律及与急性排斥反应程度的相关性，评价其在急性排斥反应预测和早期诊断中的作用, 为早期预测诊断急性排斥反应奠定基础, 同时利用新型生物传感器技术可为肺移植术后免疫系统全面监测开辟新研究领域

我们在原有大鼠肺移植的基础上，通过改进和优化手术操作，率先在国内成功建立了小鼠肺移植模型模型，使之规范化、程序化，具有简单实用，稳定性好，成功率高优点。 在此基础上对移植后的肺组织进行了病理学检查，发现了肺移植术后的排斥规律：术后3天的排斥级别以0-1级为主，术后7天以1-2级为主，术后2周则以2-3级以上病变为主，而术后2周以后则以3级以上病变为主；术后排斥反应的另一个显著特点是，排斥级别在肺内分布的不均一，约相当于三分之一的移植肺内排斥反应不完全相同，其中，尖部病变重于肺底，中央部较周边部明显。.采用流式细胞学检测了移植后肺组织和外周血内淋巴细胞的变化，结果显示，CD3+T、CD4+T和CD8+T，3个表型的淋巴细胞在有排斥反应的肺组织内均增多，且随着排斥级别的增加，CD8+T亚群增多的更为明显，CD4/CD8的比值呈下降趋势，说明效应细胞CD8+T的变化是构成T细胞动态变化的主要原因，在肺移植术后排斥中发挥着极为关键的作用。通过对移植肺组织内远离气管血管束的肺泡间隔内的淋巴细胞进行免疫组化染色后定量分析，可以看出，CD3+T、CD4+T和CD8+T作为一个整体，平均数量在有排斥反应的肺组织中高于无排斥反应者，并且，随着排斥级别的增加，该平均数呈增长趋势，提示间质内T淋巴细胞的数量在诊断肺移植术后排斥反应时具有潜在应用价值，动态观察移植肺间质组织中T淋巴细胞的变化可以用于移植术后排斥反应的监测、随访以及抗排斥药物的疗效评价。.本研究尝试性地对术后组织标本中的T淋巴细胞进行了免疫组化染色，结果显示，免疫组化能提高急性排斥反应诊断的准确性，组织切片经过免疫组化染色后，环血管的淋巴细胞浸润变得容易识别。组织切片经免疫组化染色后，呈棕黄色的淋巴细胞与周围的蓝色背景形成明显对比，呈袖状分布于血管或者支气管断面的周围，强烈地提示着排斥反应的存在。此外，低倍镜下容易漏诊的A1级病变，A3病变中向肺泡间隔浸润的淋巴细胞，以及支气管内皮内/下的单个核细胞，在周围背景的映衬下变得容易识别。