内质网钙过载离子通道TMCO1的结构和功能研究

The endoplasmic reticulum (ER) is the main intracellular Ca2+ store to maintain the Ca2+ homeostasis for proper Ca2+ signaling and key cellular functions. TMCO1 is a recently identified calcium channel that prevents endoplasmic reticulum from calcium overfilling, thereby playing a crucial role in calcium homeostasis. In response to calcium overloading, TMCO1 assembles into a functional calcium-selective channel, regulating the calcium content in endoplasmic reticulum store. The active form of TMCO1 is a homotetramer, while it disassembles to a dimer upon Ca2+ depletion. TMCO1 is a highly conserved protein among species, but its primary sequence does not resemble any calcium channel studied to date. Here we propose to determine the high-resolution structure of TMCO1 using nuclear magnetic resonance (NMR) and electron microscopy (EM) in combination. We will further study how TMCO1 can be activated by Ca2+ and how TMCO1 releases Ca2+ to the cytoplasm. The detailed structures of TMCO1 will provide the valuable knowledge of understanding the mechanistic mechanisms of TMCO1 activation and regulation, which will further benefit the studies of TMCO1 defect syndrome.

钙离子的稳态平衡对细胞的生理功能至关重要。内质网是细胞内最重要的钙库，其钙水平过高或过低都会造成钙信号紊乱，进而导致细胞生理功能异常，引发疾病。TMCO1是最近鉴定出来定位于内质网上的钙离子过载激活的钙通道蛋白。TMCO1能感知内质网中过高的钙浓度并形成具有钙离子通道活性的四聚体，将内质网中过多的钙离子排出。当内质网中Ca2+浓度下降到正常水平，TMCO1则解聚成二聚体，失去钙离子通道活性，以免Ca2+的过度释放。TMCO1的序列高度保守，但与迄今已知结构的钙离子通道序列都不相似。本项目中我们将综合利用核磁、电镜等多种结构生物学手段对TMCO1进行系统全面的结构解析，对TMCO1如何响应和转运钙离子进行深入研究，揭示不同状态下TMCO1 的分子基础和作用机制，为深入了解TMCO1的体内功能奠定基础，为相关疾病的药物研制提供思路和线索。

TMCO1是真核生物中定位于内质网一个高度保守的膜蛋白。研究发现，TMCO1是遗传性疾病脑颅胸发育异常 (CFT dysplasia) 的致病原因。近年来TMCO1蛋白被发现在多种肿瘤细胞中高表达，可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。TMCO1于2016年首次被报道是一种内质网的钙离子通道，当TMCO1形成同源四聚体时，将对内质网腔体中过量的Ca2+进行转运，从而维持内质网中钙离子的平衡。然而TMCO1的结构一直以来扑朔迷离，甚至拓扑结构都存在争议。本项目中我们综合利用核磁、晶体衍射和电镜等多种结构生物学手段尝试对TMCO1进行结构解析。我们首先收集了DdTMCO1 的核磁三共振实验数据，完成了DdTMCO1的主链归属，解析了DdTMCO1的二级结构。在此基础上，我们对DdTMCO1进行了钙离子滴定，发现DdTMCO1的DxxD motif在加入钙离子后会发生明显的化学位移的变化。然而我们发现DdTMCO1的膜外区域由于受到DPC的影响，其α螺旋二级结构遭到破坏。因此，我们进一步在大肠杆菌和昆虫细胞表达体系中对50多个物种的TMCO1进行表达结晶筛选，可惜没有获得稳定且有活性的纯蛋白。我们将DdTMCO1的核磁样品置换到Amphipol，制备成了负染电镜的样品，并在200kv的电镜下收集了数据，获得了蛋白二维平均的初步形貌。然而在2020年8月，McGilvray et. al在elife上发表了TMCO1在内质网转运体复合物中的结构，导致我们不得不调整了研究对象和目标，后期转向了包括PD-L1、DHHC3、CAC、CD28等跨膜蛋白的结构解析。当前研究结果基本完成了项目的预期计划。目前已发表5篇SCI论文，完成情况良好。