绿原酸对接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）产T2毒素抑制机理的研究

Fusarium.spp is an important fungi producing trichothecenes. Chorogenic acid was a kind of polyphenols in plant, which significantly inhibited the accumulation of toxin T2 of Fusarium sambucinum. This research will explore the biological property of F. sambucinum after treated with chlorogenic acid, such as: the colony and spore morphology, spore germinstion, sporulation, and biomass. Simulaneously detect the accumulation of T2 toxic by the method of UPLC-MS/MS; Using RT-PCR, transgenic yeast expression vector to analysis of Tri gene expression and enzyme activity related to trichothecenes biosythesis; iTRAQ was used to quantitative proteomics to explore the expression differences of protein after treatment. All these explorations will elucidate the regulation mechanism of trichothecenes synthesis in F.sambucinum treated with chlorogenic acid and find new protein regulators. Finally all these works can complement the mechanism underlying the inhibiton of plant polyphenols to trichothecenes biosythesis, provide reference for searching more effective inhibitors of mycotoxins.

镰刀菌是重要的单端孢霉烯族毒素产生菌。绿原酸是植物体内一类多酚类物质，可以显著抑制接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）产T2毒素的积累。本项目采用微生物学方法研究经绿原酸处理对F. sambucinum菌落、孢子形态、孢子萌发、产孢量和生物量的影响，并借助UPLC-MS/MS测定T2毒素积累的变化；通过RT-PCR和转基因酵母表达载体等技术手段来分析T2毒素合成相关Tri基因表达及酶活的影响；采用iTRAQ定量蛋白质组学筛选经绿原酸处理前后F. sambucinum表达差异显著且与T2毒素合成相关的蛋白，并探究其生物学功能及在T2毒素合成途径的调控作用。以期阐明由绿原酸引发的F. sambucinumT2毒素合成调控机理，并寻找到有关单端孢霉烯族毒素合成途径新的调节因子。这些研究将对多酚类物质抑制单端孢霉烯族毒素的机理做出新的补充，为寻找到更有效的真菌毒素抑制剂提供参考。

F.sambucinum是马铃薯干腐病主要病原菌，会导致采后及贮藏期间块茎严重腐烂和大量真菌毒素的积累。其中单端孢霉烯族毒素积累量最大，T2毒素毒性最强，对人类和动物的健康造成威胁。植物体内自身含有多种多酚类物质，能够抑制真菌的生长和毒素的积累，有效抵抗病原真菌的侵入。绿原酸是马铃薯体内含量最高的酚类物质，研究表明它能有效控制F.sambucinum产T2毒素而不影响菌体生长。为了进一步研究绿原酸对F.sambucinum产T2毒素的调控机理，分析了绿原酸处理后菌体生物学性状、T2合成相关Tri基因的表达、关键酶活性的影响，并通过转录组学和蛋白组学去筛选参与调控T2毒素合成相关基因和蛋白。结果表明：0.5mM绿原酸有效抑制了F.sambucinumT2毒素的积累以及毒素活性，对马铃薯块茎接种F.sambucinum后病斑直径扩展、干腐病发病率均有显著的抑制作用；T2毒素合成相关Tri基因的表达不同程度下调， Tri4基因编码的细胞色素P450单加氧酶活性也显著降低；利用蛋白质组学比较分析发现42个蛋白上调，26个蛋白下调。其中单端孢霉烯族毒素合成中Tri3基因编码乙酰基转移酶、Tri4基因编码多功能P450单加氧酶、Tri101基因编码乙酰基转移酶显著下调，糖酵解途径中3-磷酸甘油醛脱氢酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱羧酶、三羧酸循环中异柠檬酸脱氢酶、氨基酸代谢中谷氨酰胺合成酶、甲羟戊酸途径中乙酰CoA酰基转移酶等蛋白表达差异显著且可能与T2毒素合成有关。通过RNA-seq分析，有465个基因差异表达，其中上调258个，下调207个。通过GO分析，在生物过程中占比最大的差异基因是代谢过程和细胞过程，分别占同类别基因的33.52%和30.17%；在分子功能中占比最大的是催化活性和结合，分别36%和31.2%；在细胞组分中占比最大的是细胞器相关基因，为48.15%。通过KEGG分析，差异基因主要分布在翻译、糖代谢、氨基酸代谢中。综合而言，绿原酸主要是通过直接或间接的方式调控T2毒素的合成， 影响T2毒素合成相关Tri基因的表达及酶活来直接控制T2毒素的合成；影响了初级代谢和次级代谢中糖酵解、三羧酸循环、氨基酸代谢、甲羟戊酸途径中一些关键酶的表达从而调控了单端孢霉烯族毒素的合成。此外，针对目前T2毒素检测面临的问题，开发了一种快速、高灵敏检测T2毒素的方法。