钙信号系统在地黄连作障碍中作用

Calcium signals are important in plants when responding to stress. Our preliminary study found that calcium signals were involved in perceiving, conducting and responding to the effects of continuous cropping Rehmannia glutinosa L. Based on the field and simulation experiments, the following four areas will be studied on first cropping and continuous cropping in this project: (1) Spatial and temporal distribution of calcium in the root cells will be determined by EGTA. (2) The effects of rhizoshpere soil extracts of continuous cropping on calcium signal transport system and calcium ion concentration will be measured by the patch clamp technique and fluorescent probe. (3) Temporal and spatial different expression of the calcium signal transport system and the core members of calcium signal transduction system in the roots of control and treatment will be detected by qRT-PCR and Western blot. (4) Calcium signal blockers will be applied to observe the cell calcium concentration difference, the expression differences of members of the calcium signal and changes in the plant morphological and physiological indicators such as tuberous root elongation. The results will provide theoretical basis and technical support for solving the problem of continuous cropping obstacles.

钙信号是植物响应胁迫的重要系统。本课题组前期研究发现钙信号参与了地黄感知、传导和响应连作毒害。为了确证钙信号在连作毒害中的关键作用，本研究拟采用大田和模拟试验对正茬和重茬地黄从4个方面研究：①测定根部钙时空分布。用焦锑酸盐等方法测定根部细胞中钙的时空分布；②用膜片钳技术和荧光探针的方法，研究重茬地黄根区土壤浸提物对钙信号转运系统和钙离子浓度的影响；③用qRT-PCR和Western Blot技术，研究正茬和重茬地黄根部钙离子转运体系、钙信号传递系统中重要成员的时空表达差异；④钙信号阻断剂的运用。用TFP等钙信号阻断剂在块根伸长前期处理重茬地黄根部，观察细胞钙分布变化、钙信号成员表达差异及植株形态生理指标变化。本研究结果为破解地黄连作障碍难题，提供理论依据和技术支撑。

地黄是我国传统的大宗道地中药材，在我国有着悠久的栽培历史和广阔的种植面积。但是，连作障碍严重影响了地黄的可持续生产。我们前期研究发现钙信号系统在连作地黄中表现异常。为了更深入地研究钙信号系统与地黄连着障碍间的关系，本项目主要进行了如下研究：.1. 基因表达差异分析。利用solexa/Illumina高通量测序技术构建块根膨大初期头茬与重茬地黄块根基因差异表达谱，筛选响应连作胁迫的差异表达基因。其中与钙信号编码蛋白（钙通道与“钙泵”）和解码蛋白（钙靶蛋白）相关的基因表达差异显著，钙离子通道蛋白基因和细胞内钙靶蛋白基因多数被显著上调表达。这些结果由qPCR所确证，并细化。结果明确显示钙信号参与了地黄连作障碍的应答。.2.游离钙离子细胞内分布观察。本研究利用焦锑酸盐钙离子原位沉淀法，结合透射电镜检测地黄关键生长时期拉线期和块根膨大初期（这些时期由本研究通过切片和形态观察所界定）地黄块根形成层细胞内钙离子浓度变化与分布；利用钙荧光指示剂法，结合共聚焦荧光显微镜检测这两个时期头茬与连作地黄根尖组织内的游离钙离子浓度。结果显示连作地黄块根分生区组织和细胞内存在大量的钙离子沉淀，而头茬地黄细胞内则较少。.3. 钙信号阻断剂的“纠错”研究。利用钙信号阻断剂来处理连作盆栽地黄，显示在连作的情况下施用钙信号阻断剂，对于缓解连作障碍引起的毒害有明显效果。其中钙离子专一螯合剂EGTA的效果最为明显，钙离子通道抑制剂异搏定次之。不同钙信号阻断剂能够明显“调正”连作造成的相关基因的不正常表达，同时细胞内的钙离子浓度也趋向于“正常”水平（头茬水平）。.4．钙信号相关蛋白质磷酸化修饰分析。利用磷酸化蛋白分离和ITRAQ鉴定技术对连作地黄根部磷酸化蛋白质进行了分析鉴定。发现有6个蛋白是钙信号通路的关键成员，有2个蛋白质是磷脂酰信号途径的关键成员。磷脂酰信号途径也可产生钙离子作为第二信使。通过磷酸化下游分子实现信号转导途径是植物信号转导途径的共同特征。本研究直接找到了钙信号途径多个成员在连作地黄中被磷酸化，并确定了其磷酸化的具体位点，是钙信号参与连作的最直接证据。.本研究通过连作地黄体内基因表达差异、钙离子分布差异、钙信号阻断剂的应用及其钙信号途径关键成员磷酸化修饰等利用了不同技术，在不同层次、不同角度得到的研究结果，形成了完整的证据链条：钙信号途径是连作地黄体内关键的信号转导途径。