过表达番木瓜microRNA在调控叶片应答番木瓜环斑病毒侵染中的作用

MicroRNA(miRNA)-mediated anti-virus pathway is an advantaged natural stress-resistance mechanism that remain to be studied in plants. We have found that many miRNAs were specifically induced by the infection of papaya ringspot virus (PRSV) and several miRNAs may be involved in the regulation of some key genes in the PRSV infection network. The eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E), plays a key role in the initialization of virus protein synthesis, is a potential target of cpa-MIR164 and several other novel papaya miRNAs. Therefore, we supposed that a miRNA-dependent anti-virus defense mechanism might be existed in papaya. The papaya miRNAs might indirectly function in the response to PRSV infection by regulating the key genes involved in the plant-virus competition network. In this project, we plan to use artificial miRNA and transgenic technologies to overexpress miRNAs in papaya leaves, by this way, to study the function mechanisms of papaya miRNAs and provide new theories for the development of anti-PRSV papaya germ plasms.

MicroRNA（miRNA）介导的植物抗病毒反应具有天然的优势，其作用机理仍有待研究。我们发现番木瓜环斑病毒（PRSV）侵染后诱发大量番木瓜miRNAs出现特异表达，一批与PRSV侵染相关的基因是miRNA的潜在调控靶标。其中，在病毒蛋白质合成的起始中起关键作用的真核翻译起始因子4E（eIF4E）是cpa-MIR164和其它几个新型番木瓜miRNAs的潜在靶基因。我们认为在PRSV侵染过程中，存在一种依赖番木瓜miRNA的应答机制。番木瓜miRNA通过调控与PRSV互作的关键基因，间接参与了番木瓜响应PRSV侵染的过程。本研究拟运用人工miRNA和转基因技术在番木瓜叶片中过表达miRNA，验证番木瓜miRNA在调控叶片应答PRSV病毒侵染中的作用，为深入了解miRNA在番木瓜与PRSV互作过程中的作用机理和开发抗PRSV番木瓜新种质提供理论基础。

为验证番木瓜microRNA（miRNA）参与番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus, PRSV）侵染调控的相关机制，本研究系统预测和鉴定了由294个miRNA前体编码的304个mature miRNA。研究发现在PRSV处理时有大量特异表达的miRNAs（115个）；在PRSV处理时，miRNAs的表达模式有明显差异，大量miRNA呈下调趋势，与此同时，基因（转录本）的表达模式与健康对照相比呈明显上调趋势，推测认为这是受miRNA调节的结果。发现一批可能受番木瓜miRNA调控的重要靶标基因，如与抗逆相关的GRAS家族转录因子（GRAS family transcription factor）、与细胞生长相关的膜类固醇结合蛋白1（membrane steroid-binding protein 1）、真核翻译起始因子5A2（eukaryotic translation initiation factor 5a2，eIF5a2）、膜类固醇结合蛋白1（membrane steroid-binding protein 1）、WRKY转录因子（WRKY transcription factor）和转移酶家族蛋白（transferase family protein）等。运用RT-qPCR验证番木瓜miRNAs与其靶标的表达关系，证实部分miRNA及其靶标基因的表达模式存在负相关关系（P<0.05）。成功构建了cpa-MIR156b、cpa-MIR1860、cpa-MIR5521、cpa-MIR-novel-009和cpa-MIR-novel-011五个miRNAs的转基因表达载体。通过改进转化受体培养基的配置，建立和优化了番木瓜基因枪法转化技术体系，将构建成功的miRNA载体转入番木瓜胚状体，以验证番木瓜miRNA在调控叶片应答PRSV病毒侵染中的作用。此外，研究过程中新开发了一种高通量Small RNA测序获得番木瓜PRSV病毒基因组序列的方法。研究结果为深入了解miRNA在番木瓜与PRSV互作过程中的作用机理和开发抗PRSV番木瓜新种质提供理论基础。