基于Cx43-GJIC通路探讨灯盏生脉胶囊对脑缺血损伤后神经血管单元稳态的影响及机制

The target of neuroprotection after ischemic stroke is to facilitate the homeostasis of neurovascular unit (NVU) of the whole brain. Connexin 43 (Cx43) plays a key role in the structural basis of gap junctional intercellular communication (GJIC), maintaining NVU homeostasis. The concept of viewing the situation as a whole is a Traditional Chinese Medicine (TCM) theory that fits the above mentioned points, and has the potential to be tapped. Our department has undertaken a randomized double-blind controlled clinical trial to explore the curative effect of Dengzhan Shengmai(DZSM) capsule on ischemic stroke supported by the "Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Eleventh Five-year Plan Period". Results show that DZSM capsule is safe and effective in reducing the recurrence rate of stroke in patients with ischemic stroke. Our previous experimental study show that DZSM capsule can reduce the infarction volume on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) model of rats while its mechanism remains unknown. We therefore propose the hypothesis that "Cx43-GJIC parthway played an important role in the NVU protective effect of DZSM capsule on ischemic stroke" in order to clarify the underling mechanism.

缺血性中风神经保护的目标是恢复神经血管单元（NVU）的固有稳态。缝隙连接蛋白43（Cx43）是细胞间实现缝隙连接胞间通讯（GJIC）的结构基础，Cx43及其构成的GJIC对维持脑缺血后NVU神经元生存微环境的稳态极其重要，采取各种措施促使上述微环境恢复固有的稳态可能是缺血性中风治疗的有效途径。中医学的整体观念的指导思想和复方的多靶点效应针对了上述病理特点，具有可挖掘的潜力。我们在“国家十一五科技支撑计划”资助下，完成了“灯盏生脉胶囊干预缺血性中风的多中心、随机对照、双盲大型临床试验”，结果显示灯盏生脉胶囊可降低首发症状性脑梗死患者非致死性卒中再发率，改善残障程度。我们的前期实验研究显示灯盏生脉胶囊能明显减少脑缺血梗死面积，减轻缺血引起的血脑屏障超微结构的破坏，但目前机制不明。本项目提出“Cx43-GJIC通路参与灯盏生脉胶囊对脑缺血损伤后神经血管单元的保护作用”假说，以深入探讨其作用机制。

本项目以神经血管单元（NVU）稳态灯盏生脉胶囊为切入点，从connexin43(Cx43)-缝隙连接细胞间通讯(GJIC)介导NVU稳态的角度深入探讨灯盏生脉胶囊促进脑损伤后神经功能恢复的机制，可在一定程度上阐释中医药疗效的现代医学内涵。课题组通过大鼠皮质神经细胞氧糖剥夺模型 (OGD/R)和大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO) 模型，观察了DZSM胶囊对缺血性NVU损伤的影响。. 首先，我们采用体外细胞培养技术结合中药血清药理学方法，利用OGD/R技术诱导大鼠皮质神经细胞损伤模型，在离体状态下验证DZSM对脑缺血的保护作用。结果显示，低剂量组与高剂量组DZSM含药血清可以显著减轻OGD/R体外培养的原代皮层神经元的凋亡，提高细胞存活率，虽然高低剂量组之间并不存在确切的剂量依赖关系，但高剂量组对降低皮层神经元凋亡的趋势要比低剂量组明显。接着，我们利用MCAO模型，观察DZSM对脑缺血再灌注损伤的保护效果，并从Cx43角度探讨其可能机制。结果显示，DZSM可减少梗死体积、改善神经功能缺损评分，降低凋亡相关蛋白caspase3的表达量。Cx43蛋白的表达在大鼠再灌注后的3h开始升高，在12-48h维持着较高水平。我们进而采用了缝隙连接阻断剂CBX作为工具药抑制Cx43表达，以明确Cx43在DZSM对脑缺血保护中的地位和作用。结果显示，DZSM组、Cx43抑制剂甘珀酸（CBX）组、DZSM+CBX组均可在一定程度上抑制MCAO再灌注诱导的Cx43的表达，并起到减少梗死体积、改善神经功能缺损评分、降低caspase3表达量的作用。DZSM+CBX组较单纯DZSM或CBX给药可起到更好的脑缺血保护作用。另外，DZSM可以升高EPO表达量，同时改善了神经功能缺损评分与脑梗死体积。通过EPO siRNA预处理，降低EPO蛋白的表达量后，神经功能缺损评分和梗死体积在EPO siRNA与模型组之间无显著差异，提示DZSM的脑缺血保护作用，至少部分是通过调节EPO表达量实现的。而EPO对脑缺血神经血管单元的保护作用，与p - Cx43及缝隙连接介导的GJIC密切相关。从而进一步提示Cx43- GJIC在DZSM调节脑缺血神经血管单元稳态中扮演重要角色。. 本项目为DZSM的进一步临床应用提供了实验依据，且预示着对Cx43- GJIC具有调节作用的药物可能成为今后脑梗死药物开发的热点之一。