肠出血性大肠杆菌效应分子NleF通过抑制caspase-4参与其致病的分子机制研究

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) is a member of attaching and effacing (A/E) family of pathogens that can cause life-threatening infection in humans. Infections of this pathogen have outbroken in China and worldwide many times. The virulence of EHEC lacking type Type Ⅲ secretion system (T3SS) effector NleF was significantly attenuated relative to wild type, which might reasonably be interpreted as the gene playing an important role in bacterial virulence. However, the host targets and pathogenic mechanism of NleF still remain unclear. Here we show that NleF interacts with caspase-4 and decreases the protein stabilization, which inhibits caspase-4 activity and antagonizes inflammatory cell death. As caspase-4 is an essential protease in the anti-bacterial inflammatory response, we propose that the inhibition of caspase-4 dependent inflammatory cell death during EHEC infection is a new bacterial strategy to evade host innate immune response. Therefore, we would like to identify the interaction between NleF and caspase-4, investigate the molecular mechanism of NleF in regulating caspase-4 activity, and uncover the role of NleF in EHEC pathogenesis, might suggesting a potential target for anti-EHEC therapy.

肠出血性大肠杆菌EHEC是一种能够对宿主细胞造成黏附及擦拭性损伤的肠道致病菌，曾多次在世界各地引起爆发流行，严重威胁人类的生命健康。研究表明Ⅲ型分泌系统效应分子NleF缺失的EHEC毒力大大降低，提示我们NleF是EHEC非常重要的毒力因子，但其宿主靶标以及致病机制尚不清楚。我们通过前期研究发现，NleF可以与炎症信号通路中重要的蛋白酶caspase-4发生相互作用，NleF显著抑制caspase-4的活性并且下调其蛋白水平，NleF还能够抑制上皮细胞的炎症相关性死亡。因此，本项目拟通过免疫共沉淀、免疫荧光、RNA干扰、底物竞争结合等实验，进一步研究NleF与caspase-4的相互作用及其结合区域，探讨二者相互作用的生理意义，寻找NleF调控caspase-4活性的分子机理，在此基础上部分揭示NleF参与EHEC致病的分子机制，并有可能为抗EHEC感染药物的开发提供潜在的靶点。

肠出血性大肠杆菌 (enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC) 是一种能够引起严重的肠道疾病及并发症的致病菌，主要通过Ⅲ型分泌系统将其效应蛋白注入真核细胞，调控宿主的先天性免疫应答，包括细胞死亡和炎症信号通路。因此，研究Ⅲ型分泌系统效应蛋白的功能并寻找与其相互作用的宿主靶标对于探索EHEC的致病机制具有重要意义。本课题在研究EHEC的毒力蛋白的过程中，首次发现NleF抑制caspase-4介导的上皮细胞炎性死亡。首先，我们构建了NleF的缺失菌株ΔnleF与回复菌株ΔnleF/nleF，通过绘制生长曲线和免疫荧光实验发现NleF不影响EHEC的生长与黏附。接下来，细胞毒性实验和吉姆萨染色实验表明，与野生型EHEC和回复菌株ΔnleF/nleF相比，缺失菌株ΔnleF感染后，肠道上皮细胞死亡率明显升高；免疫印迹与ELISA实验表明，ΔnleF感染可增强pro-IL-1β的切割，促进成熟IL-1β的分泌，说明NleF抑制肠道上皮细胞的炎性死亡。为了探索NleF在细胞内的靶蛋白，我们利用siRNA分别敲低细胞内caspase-1,-4,-5的表达水平，发现ΔnleF感染后的caspase-4 knockdown细胞中，细胞死亡率明显降低，并且IL-1β的分泌减少，说明NleF通过caspase-4抑制细胞的炎性死亡。进一步研究发现，NleF与caspase-4特异的在体内外形成复合物，NleF通过与caspase-4的p19亚基直接相互作用，阻碍p19与p10亚基形成四聚体，从而抑制caspase-4的活性。此外，我们还发现NleF抑制caspase-1与caspase-4的相互作用，其267-270位氨基酸在其抑制caspase-4介导的炎性细胞死亡过程中是必需的。综上，我们首次证实EHEC的效应蛋白能够抑制肠道上皮细胞的炎性死亡，这可能是EHEC逃逸宿主先天性免疫应答的潜在机制，这将为探索EHEC致病的分子机制提供新的线索。