EGFL7介导缺血神经元调控血脑屏障通透性机制的研究

缺血性脑卒中是一种常见病。脑血管再灌注后并发的出血与缺血时期血脑屏障（BBB）通透性增高密切相关，但机制还不清楚。目前关于BBB通透性的调节研究多集中在血管内皮细胞、星形胶质细胞和管周细胞。而在缺血情况下，神经元作为脑内对缺氧最敏感的细胞，极有可能成为调控BBB的重要因素，但相关研究甚少。我们前期的体外研究发现，缺血的神经元通过活化星形胶质细胞可显著提高单层血管内皮细胞的通透性，但具体分子机制仍不清楚。EGFL7是神经元分泌的对氧敏感的新分子，故我们设想缺血的神经元可能分泌EGFL7激活星形胶质细胞，使其分泌血管内皮生长因子从而降低紧密连接蛋白表达，增加BBB通透性。本课题拟采用已建立的体外BBB模型、局灶性脑缺血动物模型及EGFL7基因敲除小鼠，采用RNA干扰、激光显微共聚焦等技术，初步阐明缺血条件下EGFL7介导的神经元调控BBB通透性的分子机制，为缺血性脑卒中并发症的防治提供新思路。

缺血性脑卒中是一种临床常见病，脑血管再灌注后并发的出血与缺血时期血脑屏障（BBB）通透性增高密切相关。以往对于BBB通透性的调节研究多集中在血管内皮细胞、星形胶质细胞和管周细胞。而在缺血情况下，神经元作为脑内对缺氧最敏感的细胞，极有可能成为调控BBB的早期始动因子，直接或间接调控BBB通透性，所以我们设想缺血神经元能够调控BBB通透性并试图探讨其中的细胞分子作用机制。我们采用体外细胞共培养的BBB细胞模型，发现糖氧剥夺（OGD）处理的神经元能够显著提高单层血管内皮细胞的通透性，并且这一过程需要星形胶质细胞参与介导完成。由于紧密连接蛋白在决定内皮细胞的通透性中发挥着重要作用，我们检测了紧密连接蛋白中最重要的两个代表Occludin和Claudin 5，结果发现二者蛋白水平显著降低。Occludin和Claudin 5是血管内皮生长因子（VEGF）的重要下游作用靶点，我们的结果发现在此过程中无论星形胶质细胞内VEGF水平还是分泌型的VEGF水平均显著提高。通过针对星形胶质细胞VEGF的RNA干扰技术，我们证明了VEGF是介导OGD处理神经元调控BBB通透性的关键靶分子。而缺血神经元主是如何激活星形胶质细胞产生VEGF仍不清楚。我们通过ELISA和Western等方法发现OGD处理可以显著诱导神经元产生分泌EGFL7。通过相应的RNA干扰技术，我们进一步证明了EGFL7是介导OGD处理神经元活化星形胶质细胞的关键靶分子，抑制EGFL7的表达可以显著抑制EGFR/Akt通路激活，VEGF的水平及BBB通透性的升高。同时采用动物MCAO模型也验证了细胞实验中的关键分子变化。这些结果首次证明了神经元对BBB的调控作用及分子机制：即缺血神经元可以通过表达EGFL7，激活EGFR和Akt通路，活化星形胶质细胞分泌VEGF，VEGF进一步作用于其下游靶分子紧密连接蛋白Occludin和Claudin 5，从而提高BBB通透性。这为全面认识缺血脑卒中BBB开放调控机制及潜在的干预策略提供了全新的思路。部分结果已经发表在国际权威杂志上J Neurochem, 2014 Apr;129(1):120-9. 研究证实了项目的科研设想，圆满完成预期目标。