烟草中菌根和缺磷信号相关转录因子MYCF1和PHR的生理功能及其调控途径解析

Forming the mutualistic symbiotic associations with arbuscular mycorrhiza fungi is one of the most crucial strategies adopted by plants agaist the Pi-limiting condition in the soil. In our previous work, we identified a novel cis-element (MYCS) and the transcription factors binding to it (MYCF1), which are indispensable for the transcriptional activation of mycorrhiza-induced/specific phosphate transporter genes in tobacco. In addition,we found that the conserved regulatory module for Pi starvation (PHR-P1BS)is also required for this transcriptional activation. In the present study, we intend to isolate other potential transcription factor encoding gene(s) binding to MYCS in tobacco using yeast one-hybrid system, and to investe the potential protein interaction between PHR, MYCF1 and other unknown transcription factor(s). Moreover, tissue and subcellular localization of all the transcription factors will be analyzed by transgenic plants carrying promoter-GUS fusions and bombardment experiment. Furthermore, the biological roles in mycorrhiza symbiosis of MYCF1, PHR, and other MYCS-binding transcription factors will be studied by using their RNAi knockdown and overexpressing lines, and microarray, ChIP-qPCR, and EMSA will be utilized to explore the downstream genes regulated by these transcription factors. Accomplishing this study, we will stand a good chance to elucidate the molecular mechanisms underlying mycorrhiza and phosphate signalings, as well as their potential corss-talk.

与菌根真菌形成互惠互利的菌根共生体系是植物在长期进化过程中形成的适应土壤有效磷缺乏的最重要的机制之一。我们前期工作表明，茄科植物基因组中存在保守的启动菌根调控表达的顺式作用元件MYCS及可能与之结合的转录因子MYCF1，且MYCS与缺磷信号调控因子PHR的作用元件P1BS共同调控菌根诱导基因的表达。本项目选择烟草为试材，在已克隆MYCF和PHR全长基础上，通过酵母单杂交系统继续筛选与MYCS结合的潜在转录因子基因，并在酵母双杂交体系中研究其与PHR的互作；利用启动子融合GUS报告基因、基因枪轰击洋葱表皮技术分析其组织和亚细胞水平定位情况；通过RNAi敲除和过量表达转基因材料分析鉴定MYCF、PHR及可能存在的其它结合MYCS的转录因子的生物学功能，由基因芯片结合ChIP-qPCR和EMSA技术研究其对菌根响应基因表达的协同调控。本研究有望首次在分子水平上明确植物菌根与磷调控信号的互作机制。

磷（P）是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，广泛参与植物体内的生化合成、能量转移、信号转导等代谢过程。土壤中的磷素由于化学固定和扩散迁移等因素影响，生物有效性非常低。为了应对缺磷胁迫，植物在长期进化过程中形成了一系列的适应性机制，其中包括诱导高亲和磷酸盐转运体基因的表达和与土壤中的丛枝菌根真菌形成互惠共生体系。在本项目前期，我们从茄科植物中番茄、辣椒、烟草和茄子中各克隆到3个受丛枝菌根共生诱导表达的Pht1家族的磷酸盐转运体基因Pht1;3、Pht1;4和Pht1;5。启动子功能分析证实这些基因在丛枝菌根中被诱导的表达模式受到启动子中P1BS（PHR1 binding sequence）和MYCS（Mycorrhiza transcription factor binding sequence）两个保守元件调控。在本项目中我们主要以烟草为研究对象，对P1BS和MYCS介导的菌根共生途径磷吸收利用的分子机制作了进一步研究。结果表明：1) 烟草中至少存在两个MYB家族的PHR同源基因NtPHR1和NtPHR2。NtPHR1和NtPHR2编码的蛋白都为核蛋白，且都能够和NtPht1;4启动子在酵母异源表达系统中相互作用。2) NtPHR1和NtPHR2在烟草叶片和根系中均有表达，且表达水平几乎不受缺磷和丛枝菌根共生诱导。3) 通过RNAi抑制NtPHR1和NtPHR2在烟草中的表达水平显著降低Pht1;4在丛枝菌根中的表达水平和烟草对磷素的吸收，并抑制丛枝菌根的侵染强度和丛枝形成丰度。4) 在烟草中超表达NtPHR2能够显著增加烟草叶片中磷含量，并对丛枝菌根侵染具有负效应。5) 对一个丛枝菌根特异表达的质膜质子泵基因SlHA8在烟草中的启动子表达调控研究发现，SlHA8响应丛枝菌根诱导表达的特性也受到启动子中2个类似于P1BS（vP1BS）和MYCS（vMYCS）元件调控。6) 抑制SlHA8基因的表达能够显著降低Pht1;4在丛枝菌根中的表达水平，并抑制丛枝菌根的侵染强度和丛枝形成丰度和形态发育。这些实验结果暗示了P1BS/PHR（如NtPHR1和NtPHR2）和MYCS/MYCF介导的信号途径对丛枝菌根共生界面质膜质子泵（HA8）和磷酸盐转运体（Pht1;3/4/5）的表达、菌根共生途径磷的吸收和菌根侵染强度具有协同调控作用。